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제품특징
□ 특징
● PCR 증폭을 이용한 유전자형 판정에 최적
● 마우스꼬리, 식물잎, 쌀 등에서 간단하게 DNA 추출가능
● MightyAmp DNA Polymerase를 이용한 강력한 증폭
□ 제품설명
MightyAmp Genotyping Kit는 마우스꼬리 등의 동물 조직이나 식물 조직 등으로부터 간편하게 DNA를 추출해 PCR 증폭을 하기 위한 제품이다.본 제품에 포함되어 있는 전용 추출 버퍼와 Proteinase K를 이용하여 동식물 조직 등으로부터 직접 DNA 추출이 가능하다.PCR에는 crude sample에서도 강력한 증폭능력을 가지고 있는 MightyAmp DNA Polymerase를 사용하기 때문에, 일반적인 PCR 효소로는 증폭이 어려운 PCR 저해 물질을 많이 포함한 crude 추출액에서 GC-, AT- rich를 불문하고, 광범위한 타겟의 증폭이 가능하다. 특히 2 kb정도까지의 짧은 단편에서 최고의 증폭효율을 나타내며, 적은 양의 template를 사용해도 양호한 반응성을 나타낸다.게다가 전기영동시 혼재하는 협잡물의 영향을 줄여주기 위해서, 전용 Loading Dye를 이용해 PCR 증폭 산물을 아가로스 전기영동하면, 단시간에 양호한 검출이 가능하므로 유전자형 판정에도 최적이다.덧붙여 본 효소는, 98℃까지 polymerase 활성을 억제하는 강력한 단일 클론 항체를 이용한 hot stare PCR효소이므로, 비특이적 증폭을 막을 수 있다.
□ 내용 (200 반응, 50 μl 반응시)*1
| 1.MightyAmp DNA Polymerase(1.25 U/μl) | 200 μl |
| 2.2×MightyAmp Buffer(Mg2＋, dNTP plus)*2 | 1.25 ml×4 |
| 3.5×Loading Dye | 1 ml×3 |
| 4.Extraction Buffer | 20 ml |
| 5.Proteinase K(20 mg/ml) | 200 μl |
*1 반응 용량 50 μl 기준. *2 Mg2+농도는 4 mM(2×), dNTP 농도는 800 μM each(2×). | |
□ 보존
-20℃Extraction Buffer는 개봉 후 실온보존
□ Primer 설계시 주의점
OLIGO Primer Analysis Software(Molecular Biology Insights)등의 primer 설계 소프트를 이용하여 최적의 배열을 선택하는 것이 중요하다.
- Tm값(아래식*에서 계산)이 60 ℃ 이상이 되도록 설계하는 것을 추천한다. * Tm값(℃)= [(nA＋nT)×2]＋[(nC＋nG)×4]-5
※ MightyAmp DNA Polymerase의 경우, 이노신을 포함한 primer의 사용은 피한다.
□ 증폭 산물의 말단
MightyAmp DNA Polymerase를 이용해 증폭한 PCR 산물 대부분은 3＇말단에 A가 1 염기 부가되어 있다. 그 때문에 PCR 산물을 직접 T-Vector(pMD20(Code 3270), pMD19(Simple)(Code 3271) 등)에 클로닝할 수 있다. 또, Mighty Cloning Reagent Set(Blunt End)(Code 6027)로 평활 말단화 및 인산화를 처리를 하여, 평활 말단의 벡터에 클로닝하는 것도 가능하다.
□ Troubleshooting
현상 | 문제점 | 개선방향 |
증폭되지 않는다증폭효율이 나쁘다 | Primer의 Tm값 | 위의 계산식을 참고하여 Primer를 설계한다. |
2 step PCR | 3 step PCR로 반응 조건을 변경한다. | |
3 step PCR | 2 step PCR로 반응 조건을 변경한다. (3 step PCR로 증폭되지 않는 것이 2 step로 증폭되는 경우가 있다) | |
Annealing 온도 | 2 ℃ 낮게 변경한다. | |
Cycle 수 | Cycle 수를 최대 40 cycles까지 늘린다. | |
샘플 양 | * PCR 반응액에 넣는 추출액을 줄이거나 혹은 늘린다.* 추출액에 넣는 시료의 양을 줄이거나 혹은 늘린다. | |
비특이적인 증폭 | Primer의 Tm값 | 위의 계산식을 참고하여 Primer를 설계한다. |
3 step PCR | 2 step PCR로 반응 조건을 변경한다. | |
Cycle 수 | Cycle 수를 25~30 cycles로 설정한다. |
