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| 선택 | Cat.No. | 제품명 | 가격(VAT별도) | 수량 |
|---|
제품특징
□ 제품설명
이 제품은 파라핀포매(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded, FFPE)에서 DNA를 간편하게 추출 하여 PCR 증폭을하기 위한 제품이다. Crude sample에 대하여 강력한 증폭을 나타내는 MightyAmp DNA Polymerase 와 FFPE 샘플용으로 최적화된 전용 버퍼 및 파라핀 포매 조직 절편에서 효율적으로 DNA를 추출하기 위한 시약으로 구성되어 있다. 전용 버퍼는 파라핀 포매 조직 절편에서 DNA 추출 용액에 포함된 PCR 저해 물질을 중화하는 성분이 포함되어 있다.본 제품을 사용 하면 복잡하고 시간이 소요되는 탈 파라핀 과정과 DNA 정제 작업을 수행하지 않고, 간편하고 신속하게 DNA 추출 만으로 파라핀 절편에 포함된 소량의 DNA에서 양호한 PCR 증폭이 가능하며, 많은 수의 검체 분석에도 유용하다.MightyAmp DNA Polymerase 는 98℃까지 polymerase 활성을 억제 하는 강력한 단일 클론 항체를 이용한 Hot Start PCR 용 효소이다.*주의: 파라핀포매 조직 절편 유래의 DNA는 고정 및 포매처리, DNA 추출 조작에 따라 상태가 다르기 때문에 긴 가닥의 DNA 증폭을 위한 주형으로는 적당하지 않다.증폭길이가 약 500 bp 이하의 PCR 증폭에 추천한다.
□ 내용
| 40 회용*1 | |
| MightyAmp DNA Polymerase (1.25 U/㎕) | 40 ㎕ |
| 2×MightyAmp Buffer for Card (Mg2 +, dNTP plus )* 2 | 1 ㎖ |
| Extraction Buffer for MightyAmp FFPE | 8 ㎖ |
| 20 mg / ml Proteinase K | 40 ㎕ |
* 1 반응용량 50 ㎕의 수 * 2 Mg2+ 농도는 4 mM (2× ), dNTP 농도는 800 ㎛each (2 × ) |
□ 보존 -20℃
Extraction Buffer for MightyAmp FFPE 는 개봉 후 상온 저장
□ 조작
● 파라핀 포매 조직 절편에서 DNA 추출조작은 실내 온도에서 실시한다. 반응은 thermal cycler를 이용한다.
● 슬라이드위의 파라핀 절편1 을 멸균 스파튤라 (spatula) 등을 이용하여 100 μl의 Extraction Buffer for MightyAmp FFPE가
들어있는 PCR 튜브로 옮긴다.【주의】 Extraction Buffer for MightyAmp FFPE이 침전물을 형성하고 있는 경우에는 온도를 높여 (~60℃) 서서히 교반하여
침전물을 용해한다.
● 20 mg / ㎖ Proteinase K 1 ㎕를 첨가한다.
● 60 ℃에서 15 분간 배양 후, 98 ℃에서 5 분간 처리한다.
● 실온에서 침전이 떨어질 정도로 가볍게 원심분리하여 상층액 (파라핀 추출 상층액 )을 PCR 주형으로 사용한다 2
1파라핀 포매 조직 절편은 1 ~ 1.5 cm2 상당량을 사용한다. 파라핀 절편 양이 많은 경우에는 Extraction Buffer for MightyAmp
FFPE 와 Proteinase K 사용량을 늘린다.2파라핀 추출 상층액을 보존하려면 새로운 튜브로 옮겨 -20 ℃ 에 보존한다.
● 일반적인 PCR 반응액 조성 (Total 50 ㎕ )
사용량 | 최종 농도 | |
|---|---|---|
2 × MightyAmp Buffer for FFPE | 25 ㎕ | 1 × |
Primer 1 | 15 pmol | 0.3 ㎛ |
Primer 2 | 15 pmol | 0.3 ㎛ |
파라핀 추출 상층액* 1 | ≤ 5 ㎕ | |
MightyAmp DNA Polymerase | 1 ㎕ | 1.25 U/50 ㎕ |
멸균수 | up to 50 ㎕ |
* 1 파라핀 추출 상층액을 PCR 반응의 주형으로 사용시 PCR반응 액의 1 / 10 이하로 한다.
□ Primer 디자인에 관하여
가능한 OLIGO Primer Analysis Software ( Molecular Biology Insights 사) 등 primer 디자인 소프트웨어를 이용 하여 최적의 배열을 선택합니다.
Tm 값 (아래 식*기준)이 60 ℃ 이상이 되도록 설계할 것을 권장한다. * Tm 값 ( ℃) = [ (nA + nT ) × 2 + ( nC + nG ) × 4] -5
□ Primer 디자인에 관하여
신장(extension) 온도를 68℃로 설정한 3 step PCR 표준 조건이다.[3 step PCR ]
| 98 ℃ | 2 min. * 1 | |
| ↓ | ||
| 98 ℃ | 10 sec. | ┐ |
| 60 ℃ | 15 sec. | │ 40 cycles |
| 68 ℃* 2 | 30 sec.* 3 | ┘ |
MightyAmp DNA Polymerase의 경우 inosine을 포함하는 primer 사용은 피한다.* 1 강력한 hot start 항체를 사용하고 있기 때문에 반드시 98 ℃, 2 분 초기 변성을 실시하여 항체를 열 변성 시킨다.* 2 3 step PCR 의 경우 신장 온도를 68 ℃로 설정 한다.* 3 500 bp 이하의 증폭 신장 시간
□ 전기영동
MightyAmp DNA Polymerase를 이용하여 증폭한 PCR 산물을 전기 영동 할 경우 TAE Buffer의 사용을 권장한다. TBE Buffer를 사용하면 이동 패턴이 다소 퍼지는 현상이 발생하여 깨끗한 영동 결과를 얻지 못할 수 있다.
□ PCR 산물에 대해
MightyAmp for FFPE를 사용하여 증폭한 PCR 산물의 대부분은 3" 말단에 A가 1 염기 추가되어 있다. 따라서 PCR 산물을 그대로 T - Vector ( pMD20 : TaKaRa code 3270, pMD19 (Simple ) TaKaRa Code 3271 )에 클로닝 할 수 있다.
□ 문제해결
현상
문제점
대책
증폭되지 않거나증폭 효율이 좋지 않다.
primer의 Tm 값
위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인한다
Annealing
2 ℃ 씩 내려 본다
시료량
시료의 사용량을 감소 또는 증가시켜 본다.
비 특이적 증폭이현저하다.
primer의 Tm 값
위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인 한다.
3 step PCR
2 step PCR 을 시도해 본다
Cycle 수
35 ~ 40 cycles 설정
현상
문제점
대책
증폭되지 않거나증폭 효율이 좋지 않다.
primer의 Tm 값
위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인한다
Annealing
2 ℃ 씩 내려 본다
시료량
시료의 사용량을 감소 또는 증가시켜 본다.
비 특이적 증폭이현저하다.
primer의 Tm 값
위의 추천 계산식을 이용하여 primer를 디자인 한다.
3 step PCR
2 step PCR 을 시도해 본다
Cycle 수
35 ~ 40 cycles 설정
