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제품특징
□ 특징
● Streamlined method : genome editing 이후, 다양한 Indel sequence 확인
● CRISPR/Cas9 뿐만 아니라 TALENs, ZFNs 이후 Indel identification에사용 가능
● Ultrafast protocol : Cell direct PCR과 In-Fusion Cloning을 조합한 빠른 프로토콜
● Complete kit : target 의 증폭, 복제, sequencing용 샘플 제작에 필요한 모든 시약 포함
□ 제품설명
Guide-it IndelIdentification Kit는 genome editing (CRISPR/Cas9,TALENs, ZFNs) 이후 얻어진Indel (Insertions and deletions)의다양성을 확인하는 데 최적화된 제품이다. 본 제품은 DNA 서열분석을 위한 target site의 amplify, clone,sequencing용 샘플 조제를 위한 모든 제품과 프로토콜을 구비하고 있어 신속하고 신뢰성 높은 결과를 얻을 수 있다. Terra PCR Direct polymerase를 사용하므로 DNA 추출, 정제 없이 crude cell lysate로부터 genomic DNA fragment를 증폭할 수 있으며, 증폭산물은 In-Fusion Cloning 방법을 이용하여 pre-linearizedpUC19에 바로 cloning 할 수 있다. 이후제품 내에 포함된 Stellar Competent Cell에transformation 이후 생성된 Colony는colony PCR 하여 target region을 증폭한 후 시퀀싱하여 Indel 서열을 분석할 수 있다 (그림 1, 그림 2).
그림1. The Guide-it Indel Identification Kit provides a complete workflow foridentifying the variety of insertions and deletions (indels) introduced bynuclease-based genome editing. The protocol uses direct PCR to amplify a genomic DNA fragment (~500 to 700 bp) containing thetarget site directly from crude cell lysates (step 1). The resulting amplifiedfragments contain a pool of edited target sites from individual cells. ThesePCR products are cloned directly into a pre-linearized pUC19 vector using theIn-Fusion cloning system (step 2).After transformation of an optimized E.coli strain, colony PCR is used to amplify the target site from the plasmid(step 3). DNA sequencing is then used to identify the different indelsgenerated at the targeted genomic site (step 4).
그림2. Identification of insertions and deletions (indels) in the CD81 gene afterCRISPR/Cas9 targeting. HeLa cells were transfectedwith plasmids encoding Cas9 and an sgRNA targeting the CD81 gene. The Guide-itIndel Identification Kit was used to prepare CD81 target sites for DNA sequenceanalysis. The sequencing data from six clones was aligned with the wild-typesequence, revealing a broad range of indels in the CD81 gene.
□ 적용
● Detecting insertions and deletions introduced in mammalian genomic DNA
● Characterizing the variety of indels that are present in a cell population after nuclease-based gene editing
□ 구성품
● Guide-it Indel Identification Components
● 110μl Terra PCR Direct Polymerase Mix
● 3x 1 ml 2X Terra PCR Direct Buffer (with Mg2+, dNTP)
● 400μl Extraction Buffer 1
● 40 μl ExtractionBuffer 2
● 10 μl pUC19Cloning Vector, linearized (50 ng/μl)
● 200 μl ColonyPCR Forward Primer (15 μM)
● 200 μl ColonyPCR Reverse Primer (15 μM)
● 6x 1 ml PCR-Grade Water
● In-Fusion HD Cloning Kit
● NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit
● Stellar Competent Cells
□ 보존
Guide-it Indel Identification | -20℃ |
In-Fusion HD Cloning Kit | -20℃ |
NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | 실온 |
Stellar Competent Cells:-70℃ | -70℃ |
그 외 구성품 | -20℃ |
