□ 농도 10~50 U/㎕

​

□ 형상

​

​

□ 보존 -20℃

​

□ 첨부 Buffer 조성(10×)

​

* BSA가 침전할 우려가 있으므로 동결·융해는 가능한 한 피해 주십시오.

​

□ 기원

​

Escherichia coli B infected with T4 am N82

​

□ 제품설명

​

본 효소는 ATP를 AMP와 PPi로 분해하여 그 에너지로 5’-P말단의 oligonucleotide와 3’-OH 말단의 oligonuceotide를 결합시키는 효소이다.최소기질은 NpNpNOH(3’-OH oligomer, 수용체), pNp(5’, 3’DP monomer 공여체)이다. 라이게이션 효율은 수용체, 공여체 각각의 염기에 영향을 받으며, 일반적으로 수용체에는 purine을, 공여체는 pyrimidine을 포함하는 것이 효율이 좋다. DNA는 RNA보다 상당히 효율이 떨어지고, 구조적으로 3’말단에 가까운 P 말단을 갖는 RNA도 효율이 좋지 않으며, 3’- uridine oligomer 또한 수용체로써 부적당하다. 3’수용체의 경우는 BAP처리에 의하여 효율을 높일 수 있다.5’, 3’DP monomer 공여체로써는 C ＞ U ＞ A ＞ G의 순으로 높은 효율을 가지고 있다.

​

□ 활성의 정의

​

Oligo(A)n을 기질로 하여 5℃, 10분동안 1 pmol의 [5’-³²P]pCp를 산불용성 침전물로 사용하는 것을 효소활성 1 U로 한다(RNA 3’말단 표식반응).

​

□ 활성측정용 반응액 조성

​

​

□ 순도

​

- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물을 37℃, 24시간 반응해도 DNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.- 100 U의 본 효소와 1 ㎍의 16S와 23S rRNA를 37℃, 24시간 반응하여도 RNA의 전기영동 패턴에 변화가 없다.- 20 U의 본 효소와 6 ㎍의 λDNA-Hind III 분해물 또는 6 ㎍의 λDNA-Pst I 분해물을 37℃, 24시간 반응하여도 각 DNA는 T4 DNA

ligase에 의해 90%이상 연결되고, 그중 100%가 각각 Hind III 또는 Pst I에 의해 재절단된다.

​

□ 사용상의 주의

​

- 4℃ 이하 보존에서 약 1년간 안정하다.- 분자간 라이게이션의 최적반응 온도는 5~15℃로, 그 이상 높아지면 억제된다.- PEG 공존하에서 반응은 촉진되나, 반응특이성에는 변화가 없다.- 연결반응의 효율을 높이기 위해서는 효소농도는 높고 ATP 농도는 기질농도를 고려하여 가능한 낮게 하는 것이 좋다.- 10× 첨부 버퍼에 0.1% BSA를 직접 첨가하면 다량의 백색침전이 생기므로 반응액을 조제할 때는 다음의 순서로 시약을 첨가한다. dH₂O → 10× 첨부 버퍼 → 0.1% BSA → 기질 RNA 또는 DNA

​

□ 용도

​

- 단일가닥 RNA와 단일가닥 DNA의 3’-OH 말단의 표식- 단일가닥 oligo RNA, 단일가닥 DNA의 합성- 완전한 길이의 cDNA 합성

​

□ 참고

​

Yeast tRNA^phe를 기질로 하였을 때, 상기 반응액 중에 50 U의 본 효소를 5℃, 16시간 처리하면 80% 이상 tRNAphe의 3’말단이 표식된다.