□ 특징

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● 간단하고 민감하게 promoter 활성을 관찰

● 강력하고 안정적인 signal

● 살아 있는 세포 분석 - time course 실험에 적합

● High-throughput 실험에 최적

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Clontech의 live cell secreted reporter는 다른 transcriptional reporter 이상으로 많은 장점을 갖고 있다. 이들은 배양 배지로 분비되기 때문에 반복적으로 같은 배양액을 시료로 하여 유전자 발현에 대한 kinetics를 측정할 수 있다. 또한 Northern blot, RNase protection assay, Western blot과 같은 방법을 사용하여 같은 세포로 추가적인 연구를 할 수 있으며, 96-well 에서 1,536-well plate의 범위까지 분석할 수 있다.

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□ Ready-To-Glow Live Cell Secreted Reporter System

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Ready-To-Glow System은 secreted Metridia luciferase reporter에 기반을 두고 있으며, enzyme-based system의 민감성과 live-cell assay의 이점을 결합시킨 제품이다. 세포를 파쇄하지 않고 transfection 된 세포의 상층액으로 분비된 reporter 효소의 활성을 one-step으로 측정함으로써 promoter 활성을 관찰할 수 있다 (Figure 1).Firefly와 Renilla luciferase는 cytosol protein이기 때문에 reporter를 검출하기 위해서는 반드시 세포를 파쇄하고 기질을 첨가하여야 한다. 따라서, timecourse 연구에서는 transfection 된 세포에서 의미 있는 결과를 얻기 위해선 시간 별로 세포를 파쇄해야만 하는 불편함이 있다. 그러나 Ready-to-Glow Luciferase System은 이러한 장애 요소을 제거시켰다.Metridia secreted luciferase는 Renilla와 firefly luciferase와 같이 분비되지 않는 luciferase reporter와 비교하여 기질 첨가 후 signal 강도의 변화 없이 더 높은 signal 안정성을 보였다 (Figure 2). 이것은 한번에 다수의 시료를 다루기 쉽도록 해준다. 또한 signal intensity가 기질 첨가 후 시간에 따라 감소하더라도, 전체적인 발현 배수는 30 분 후에도 같은 상태로 남아있게 된다(Figure 3).재조합 Metridia luciferase 활성은 96-well 형태 (40 fg Metridia luciferase per ml of sample)에서 매우 낮은 검출 한계 (~2 fg per well)를 가지며, 아주 넓은 범위의 농도 (적어도 6 log)에서도 직선적인 결과를 나타낸다. 이 효소의 dynamic rage는 다수의 세포 종류와 plate 형태에서 측정이 되었으며, 희석된 배지 상층액에서 signal은 적어도 4 자리 수 (0.01% ~ 100% ; 2)에 대하여 선형을 나타낸다. Z、값은 0.66이며, 이것은 낮은 가변성과 함께 높은 dynamic range를 대변해 준다. Metridia luciferase는 2% DMSO에서도 안정하다. Hight throughput application을 위한 더 많은 정보가 필요하다면 Clontech website에서 확인할 수 있다.Figure 1. Flow chart of the Ready-To-Glow Secreted Luciferase Reporter System.Figure 2. High signal intensity and stability using secreted Metridia luciferase. CHO cells were plated into 96-well plates and transiently transfected with CMV-driven constructs encoding non-secreted firefly luciferase, non-secreted Renilla luciferase, and secreted Metridia luciferase. 24 hr after transfection, luciferase activity in equivalent samples was analyzed by addition of the recommended substrate. The signal was measured at different timepoints over a period of 45 min. neg = negative control.Figure 3. Monitoring promoter activation using the sequence-optimized secreted Metridia luciferase reporter. HeLa cells were transiently transfected with a vector construct containing the NFκB response element driving the expression of sequence-optimized secreted Metridia luciferase. 24 hr after transfection, the media was removed and replaced by media with or without TNF-α (100 ng/ml) to activate the NFκB signal transduction pathway. Six hr after addition of TNF-α, samples of the media were removed and analyzed for Metridia luciferase activity. The fold induction was calculated for different time points following the addition of substrate.

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□ Ready-To-Glow Dual Secreted Reporter System

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Ready-To-Glow Dual Secreted Reporter System은 Ready-To-Glow Secre ted Luciferase와 secreted alkaline phosphatase (SEAP)의 2 종의 분비형 report로 구성되어 있으며, reporter-specific substrate를 이용하여 측정하고 구별할 수 있다. 두 reporter의 secretion kinetics은 매우 유사 하여 (Figure 4), 세포 배양 배지에서 측정되는 한 reporter의 양은 promoter 활성을 정확하게 반영한다. 이러한 dual-reporter 시스템은 다양한 형태로 두 promoter의 활성 변화를 관찰하도록 해준다 (Figure 5). 하나의 reporter는 transfection 효율을 측정하기 위한 control로 사용하고, 다른 하나는 목적 promoter를 관찰하기 위해 사용할 수 있다.

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□ Great EscAPe SEAP Reporter System

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Secreted Alkaline Phosphatase (SEAP)은 transfection된 세포에서 RNA 발현 수준에 비례하여 배양 배지로 분비된다 (Figure 5). SEAP assay는 효소 농도의 104 배 범위까지 선형을 이룬다. Clontech은 chemiluminescent와 fluorescent substrate를 모두 제공하며, chemiluminescent assay는 SEAP 단백질 10-13 g 까지도 검출할 수 있다. Fluorescent assay는 firefly luciferase assay 보다 덜 민감하지만, 대부분의 실험에 적합하다.

Figure 4. Similar secretion kinetics of Metridia secreted luciferase and SEAP enable accurate comparisons of promoter activity. HeLa cells were transiently transfected with either pMetLuc-Control or pSEAP-Control in six-well plates. Media samples were collected at each time point and each sample was tested in triplicate.

Figure 5. Monitoring activation of two promoters simultaneously. HEK 293 cells cotransfected with pNFκB-TA-MetLuc and pCRE-SEAP constructs were treated with fresh media alone or with media containing either 1,000 ng/ml TNF-α or 10 μM forskolin. Samples of culture supernatant were collected and assayed 7 hr later.

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□ Components & Storage Conditions

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각 제품 구성물과 보관조건은 Certificate of Analysis 를 참조하십시오.