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제품특징
□ 특징
● Staphylococcus aureus 유래의 SaCas9를 이용한 One vector CRISPR/SaCas9 System
● Adeno-associated virus (AAV)를 이용하여 SaCas9과 sgRNA를 세포 내 도입
● Transfection이 어려운 Mammlian cell (분열, 비분열세포)에서 Genome Editing
● AAV에 의한 Cas9 도입은 genome integration을 억제하고 Cas9의 발현을 지속시킬 뿐만 아니라, off-target effect를억제
□ 제품설명
AAVpro®CRISPR/SaCas9 Helper Free System은 single guide RNA (sgRNA)와 SaCas9 (from Staphylococcusaureus) 유전자를 발현하는 Adeno-associated virus 2 (AAV2)particles를 Helper virus 없이 제작 가능한 제품이다. 본 제품은 S.aureus 유래의 SaCas9과 sgRNA를 하나의 벡터에서 발현할 수 있는 single vectorsystem이다 (그림 1). S.aureus 유래의 SaCas9nuclease의 유전자 크기는 3.3 kb로써, 기존에사용되어왔던 Streptococcus pyogenes 유래의 SpCas9 nuclease (4.1 kb) (보통 Cas9이라고명명함) 보다 약 1 kb 정도 작다. 그렇기 때문에 하나의 AAV vector에 sgRNA 발현 유전자와 SpCas9 발현 유전자를 한꺼번에 삽입이가능하게 되었으며, 이는 in vitro 및 in vivo에서 다양한 세포에서 효율적으로 Genome editing이 가능하다. 반면, SaCas9의 경우 SpCas9과PAM 서열 (Proto-Spacer Adjacent Motif) 및 target sequence의 길이 (20 - 22 nt)가 다르므로 sgRNA 디자인 단계를 고려할 필요가 있다 (그림 2). 본 제품에 포함되어 있는 SaCas9/sgRNA 발현 AAV vector, AAV packaging에 필요한 pRC2-mi342vector 및 pHelper vector를 HEK293T 세포주에 도입을 하면, Helper virus 없이고순도 및 높은 Titer의 AAV particle을 얻을수 있다. 본 제품에는 AAV production 및 CRISPR Genome editing을 위한모든 제품 (Ligationmix, Stellar™ Competent cells, AAV Extraction buffer 등)이 포함 되어있다.
그림 1. pAAV-Guide-it-1 vector의 SaCas9과 sgRNA 발현 pAAV-Guide-it-1vector를 패키징하고 있는 AAVparticle을 Target cell line에transduction함으로써, SaCas9 단백질과sgRNA 유전자가 동시에 함께 발현된다. 
그림 2. SaCas9의PAM sequence SaCas9의 PAM 서열은NNGRR (N=A, T, G, C / R=A/T)이며, PAM으로부터 3 - 4 bp의 염기를 절단한다. 또한, sgRNA의 Target sequence는 20 - 22nt를 권장한다.
그림 3. AAV를 이용한SaCas9과 SpCas9의 Genome editing 효율비교 CYP2 Exon1 유전자 중, 2개의 다른배열을 editing 표적으로 하여 Two vector system인 AAVpro®CRISPR/Cas9 Helper Free System (AAV2) (Code 632608)과 Sinlge vector system인 AAVpro® CRISPR/SaCas9Helper Free System (AAV2) (Code 632619)를 사용하여 AAVmediated CRISRP/Cas9 editing을 수행하였다. 12-well plate에 1 x 105개의 세포를 seeding, overnight 배양 후, SpCas9 or SaCas9 virus vector를 1 x 105 MOI로 감염시켰다. 72시간 후, 세포를 회수하고 Genome DNA 변이도입 효율을 Guide-it™ Mutation Detection Kit (Code 631443)을 사용하여 분석 및 비교하였다.
□ Applications
AAV-based delivery of a user-defined sgRNA and Cas9 for mammalian genome editing using CRISPR/Cas9 technology
□ 구성품
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Helper Free System (AAV2) (Cat. No. 632619)
● AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
● Guide-it™ Ligation Components
● Stellar™ Competent Cells
● pRC2-mi342 Vector
● pHelper Vector
● AAVpro® Extraction Solution
AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector System (Cat. No. 632618)
● AAVpro® CRISPR/SaCas9 Vector Set
● Guide-it™ Ligation Components
● Stellar™ Competent Cells
□ 보존
Stellar™ Competent Cells: -80 ℃기타: -20 ℃(AAVpro® Extraction Solution은 융해 후, 실온 보관)
